Než se pustíme do přípravy obilného matečného louhu (podhoubí obilí), budeme potřebovat nějaké pomůcky a materiály, a to je přesně to, co potřebujeme.
(A). Sklenice s filtrem. (B). Tlakový hrnec nebo autokláv. (B) Injekční stříkačka obsahující suspenzi spor. (G). Pšeničné zrno. (D). Ethanol. (E). Jednorázové chirurgické rukavice a lékařská ochranná maska.
Kromě výše uvedených položek budeme potřebovat buď lihovou lampu nebo butanový hořák (pro kalcinaci jehly). Je také velmi žádoucí mít buď laboratorní skříň s laminárním prouděním nebo odkládací schránku. Oba velmi usnadňují práci a zvyšují vaši šanci na snížení míry kontaminace vašich plechovek s obilím.
Podíváme se na několik metod výroby obilného matečného louhu, tradičních i inovativních. Tato inovativní metoda eliminuje jeden mezistupeň při přípravě obilí, a to proces jeho vaření.
Prvním krokem je příprava obilí.
Naplňte své sklenice přibližně do poloviny obilím, abyste změřili, kolik obilí budete potřebovat k jeho vaření.
Jakýkoli druh obilí během vaření zvětší svůj objem, takže v době, kdy bude hotové, bude jeho objem činit až % objemu zavařovací sklenice.
Neměli byste dovolit, aby vaše zrno zabíralo téměř celý objem nádoby, protože její obsah nebude „přehlcen“ během procesu kolonizace mycelia celé hmoty zrna. Proces třepání nádobou umožňuje „rozbít“ kolonizované zrno na jednotlivá zrna a také zrno promíchat, aby se zlepšil proces jeho přerůstání myceliem.
Jakmile odměříte obilí, které máte, nasypte je do kbelíku/umyvadla a opláchněte studenou vodou.
Tato fáze je nezbytná k umytí zrna a odstranění všech nečistot a také pomůže odstranit „povrchový“ škrob přítomný na skořápce zrna, takže jednotlivá jádra zrna se neslepují, což narušuje proces protřepávání obsahu ve sklenici a narušuje proces znečištění mycelia zrna (zrno se může slepit do jedné velké hrudky a mycelium do ní nebude schopno proniknout), a to také ztěžuje odstranění hotového mycelia zrna z sklenice.
Pokud použijete speciální filtrační sáček, není oplach zrna tak nutný, protože se sáčkem mnohem snáze manipuluje a rozloží celý obsah.
Po prvním proplachování bude voda špinavá, takže během tohoto postupu budete muset vodu několikrát opatrně vypustit a nahradit novou dávkou čisté vody. Ujistěte se, že je voda čistá a dokončete fázi mytí obilí. Jakmile je voda čistá, nechte v ní zrno 24 hodin, aby došlo k procesu hydratace/nasycení.
Ujistěte se, že máte dostatek vody, aby pokryla celý objem zrna, a aby bylo dostatek místa pro nabobtnání zrna. Proces předmáčení zrna mimo jiné pomáhá „probudit“ endospory bakterií, tedy přenést je z „spícího“ stavu do aktivní fáze. To je pomůže následně zničit během sterilizace.
Po této proceduře namáčení zrna lze další proces jeho přípravy rozdělit na dva postupy: vaření zrna před procesem sterilizace nebo samotný proces sterilizace zrna.
Podívejme se blíže na tyto dvě fáze přípravy obilí.
Po 24 hodinách vodu slijte, zrno přendejte do hrnce, zalijte dostatečným množstvím čisté vody (aby voda zrno pokryla) a vařte až 10 minut. Pokuste se zrno během vaření neustále míchat. Pokud vaše zrna vypadají, jako by měla „prasknout“ (dokonce už tam budou zrna „prasknout“, ale jejich procento by nemělo překročit 5–7 % z celkové hmotnosti zrna), je čas je odstranit z tepla, i když se to stalo o méně než 10 minut později.
I když budete zrno dále vařit, procento vlhkosti v něm se tak výrazně nezvýší (vaření zrna dalších deset minut vede ke zvýšení vlhkosti zrna ze 48 % na 50 %), ale procento prasklého zrna se zvyšuje ze 7% na 12-18%. Pokud je procento prasklých zrn větší než 30 %, pak takové zrno není vhodné pro budoucí produkci mycelia zrna.
Druhý způsob vaření obilí spočívá v tom, že jakmile se pánev s obilím začne vařit, sejme se ze sporáku a položí na bavlněnou přikrývku a omotá kolem pánve (zabrání se tak procesu nadměrného přenosu tepla). Takové zrno by mělo stát v horké vodě 2 až 4 hodiny (v tomto případě po hodině zkontrolují, zda je zrno hotové nebo ne). Pravidelně zahřívejte pánev nebo použijte termosku. Při tomto procesu je procento „prasklých“ zrn mnohem menší a taková zrna jsou méně náchylná k procesu slepování.
Během procesu vaření přechází určité množství živin ze zrna do vody s jejich nevratnou ztrátou. Přestože tento proces není tak významný, je třeba si jej připomenout. Obrázek níže ukazuje, jak se zrno, které prošlo procesem namáčení a vaření za horka, vyhladí.
Obě metody jsou zcela funkčním způsobem přípravy zrna pro proces sterilizace v autoklávu. Výběr je tedy na vás. Vařené zrno má navíc měkčí skořápku než zrno namočené v horké vodě (dostane se do autoklávu).
Existuje způsob, jak zkontrolovat, zda je zrno „připraveno“ pro proces sterilizace v autoklávu či nikoli (zda není převařené).
První znak je vizuální (u obilí, které prošlo fází vaření). Pozor na bílé jádro zrna (takto by se zrno mělo žehlit s optimální vlhkostí), později v autoklávu se vlhkost rovnoměrně rozloží po celé hmotě zrna a toto jádro nebude vidět.
Druhý způsob (pro jakékoli zrno) je umístit zrno na ukazováček a zmáčknout jej nehtem. V tomto případě by zrno mělo mít určitou pružnost a při rozdrcení by nemělo vypadat jako „kaše“.
Je lepší zrno nedovařit než převařit! Během procesu „horkého nálevu“ není pozorován proces „převaření“ zrna.
Proces inovace v přípravě obilí, který vám chceme nabídnout, je provádět proces vaření (nebo ještě lépe „horký nálev“) ve vápenném roztoku s koncentrací pracovního roztoku 0,5 až 2,5 %. Tato technologie se osvědčila jako nejlepší a připravené zrno nevyžaduje vaření ani praní.
Zrno napuštěné vápenným roztokem při dané koncentraci pracovního roztoku má sklon k menšímu shlukování a menšímu kysání a v důsledku toho k menšímu množství výplivů. To platí zejména při použití žita jako zdroje královského obilí. Zároveň je zrno obohaceno o vápník, který příznivě působí na růst mycelia, přičemž zcela odpadá pufr, který se používá při tradičním způsobu přípravy obilí (směs křídy a sádry). Po procesu sterilizace by pH prostředí mělo být 6,5-6,7 a je pro mnoho druhů hub nejoptimálnější.
V tomto případě se fáze přípravy zrna příliš nemění. Zrno se nechá nabobtnat a prochází procesem „horkého louhování“ ve stejné vápenné vodě (s danou koncentrací). Po procesu odsátí přebytečné vody ze zrna (na sítu) se naloží do sklenic nebo sáčků (bez mytí) a za stejných podmínek se provede jeho sterilizace. S touto technologií nemůžete používat hliníkové nádobí!
Bez ohledu na to, jak zrno na proces sterilizace připravíme (vařením nebo vyluhováním v horké vodě), dalším krokem bude proces jeho mytí.
Druhá fáze – mytí obilí
Pro tyto účely je dobré použít cedník, provádějící proces mytí zrna pod proudem vody (pokojové teploty), za stálého míchání zrna na povrchu cedníku pod tekoucí vodou. Účelem tohoto postupu je zbavit povrch zrna přebytečného škrobu, což v konečném důsledku povede k menšímu lepení. Během procesu vaření přechází určité množství živin ze zrna do vody s jejich nevratnou ztrátou. Přestože tento proces není tak významný, je třeba si jej připomenout.
Obilí připravené ke sterilizaci v sáčcích se nesmí prát. Tam je mnohem snazší jej „rozbít“ na samostatná zrna. Kromě toho zrno pro sáčky umožňuje velké procento „prasknutí“ zrna (až 15 %).
Třetí fáze – Sušení zrna
Další fází přípravy zrna pro proces jeho sterilizace je proces sušení. Proces sušení obilí je relevantní pro obilí připravené varem a méně relevantní pro obilí připravené vyluhováním v horké vodě (k tomu stačí, aby voda z obilí úplně stékala, když leží na sítu).
Pro proces sušení jednoduše položte zrna na čistý vaflový ručník (k tomuto účelu můžete použít vysoušeč vlasů nebo podlahový ventilátor). Po chvíli zrno jen zamíchejte, aby oschlo, ale hlavně tento proces kontrolujte, nenechte zrno vyschnout! Pokud objem obilí, které připravujete, není tak velký, můžete zvolit „prasklá“ obilná jádra (nemělo by jich být mnoho!). Správně vysušené zrno by se nemělo „lepit“ na suchou dlaň. Jakmile toho dosáhnete, proces ušně je u konce.
Čtvrtá fáze – Proces sterilizace zrn
Sklenice naplňte obilím do tří čtvrtin jejich plného objemu a pevně přišroubujte víčka a filtry. Víčka sklenic přikryjte fólií (víčka obalte fólií) a vložte je do tlakového hrnce/autoklávu. Ujistěte se, že máte na spodní straně tlakového hrnce speciální stojan nebo na spodní straně kovový stojan. Plechovky nelze umístit přímo na dno tlakového hrnce!
Je vhodnější používat stojany s dlouhými nohami než krátkými, ale opět to závisí na výšce vašeho tlakového hrnce (autoklávu).
Je také důležité pamatovat na to, že zavařovací sklenice by neměly být naloženy příliš těsně a zavařovací sklenice (zejména sáčky) by se neměly dotýkat stěn tlakového hrnce.
Na dno tlakového hrnce umístěte gril (stojan) a dovnitř vložte plechovky s obilím (na vrchu víka zabalené fólií) a zalijte vodou. Důležité je nalít takové množství vody, aby vystačilo na celý proces sterilizace. Pokud se používají pouze plechovky, lze nalít více vody (přibližně do poloviny výšky plechovky); pokud se používají sáčky, nemělo by se to dělat!
Pokud jste zpočátku nalili málo vody, pak když se odpaří (vychází jako pára z ventilu), sáčky se roztaví a obsah plechovek „spálí“. Pokud tedy během procesu sterilizace máte pocit, že voda došla (z ventilu přestala vycházet pára), vypněte tlakový hrnec. Počkejte, až tlak v tlakovém hrnci klesne na atmosférický tlak (k tomu je velmi důležitý manometr) a odšroubujte víko tlakového hrnce. Měli byste mít po ruce vroucí vodu, přidat ji do tlakového hrnce a pokračovat v procesu sterilizace.
Do tlakového hrnce nelijte studenou vodu! (Banky prasknou). Proto vždy vezměte adekvátní velikost nádoby, výšku stojanu a výšku autoklávu/tlakového hrnce.
Sterilizujte sklenice/sáčky při tlaku 15 stop na čtvereční palec (toto je stupnice tlaku na všech „západních“ tlakových hrncích a autoklávech) po dobu 60 až 90 minut, pokud váš tlakový hrnec nemá manometr, pak začněte měřit na „ nejhlasitější syčení páry unikající.“ z ventilu tlakového hrnce“, a nikoli od začátku instalace tlakového hrnce na hrnec. Doba sterilizace závisí na objemu naloženého zrna a čím větší je jeho objem, tím déle trvá sterilizace.
Tlakoměr nainstalovaný na víku tlakového hrnce a indikující tlak. Některé modely domácích autoklávů umožňují regulaci tlaku (jeho zvýšení nebo snížení) úpravou jeho pojistného ventilu.
Po uplynutí 60 (90) minut nechte tlakový hrnec vychladnout. Sklenice vyjměte, když tlakoměr klesne na atmosférický tlak (nebo dokud tlakový hrnec nevychladne), nebo můžete tlakový hrnec nechat chladnout 12 až 24 hodin v závislosti na velikosti sklenic.
Mycelium je velmi citlivé na teplo (parametr tepelné úmrtnosti pro podhoubí většiny hub byl nastaven na 41 °C) Inokulace, když je zrno příliš horké, zabije nebo zpomalí růst podhoubí nebo spor, proto je lepší neužívat rizika.
Krok dva – proces očkování plechovek a pytlů hotového obilí
Jakmile plechovky s obilím úplně vychladnou, umístěte plechovky/sáčky do blízkosti filtru skříně s laminárním prouděním nebo do přihrádky na rukavice. Používáte-li suspenzi spor v injekční stříkačce, není bezpodmínečně nutná odkládací přihrádka/kukla s laminárním prouděním. Pokud pro očkování používáte „klíny“ z agarového živného média s myceliem, pak jsou taková technická zařízení prostě nezbytná.
Postříkejte všechny povrchy, včetně sklenic a sáčků, roztokem alkoholu (použijte nástavec na lahvičku s alkoholem). Nezapomeňte si umýt ruce antiseptickým mýdlem nebo nosit chirurgické rukavice. Upozorňuji, že nemám rukavice, protože jsem si dobře umyl ruce a také je „nastříkal“ alkoholem.
Nastříkejte roztok alkoholu (nejméně 70% koncentrace) k dezinfekci pracovní plochy. V tomto případě by neměla být skříň s laminárním prouděním zapnuta. Pokud používáte odkládací schránku, nepoužívejte tam lihový roztok, ale použijte jiná antiseptika, která neobsahují alkohol, jinak při rozsvícení lihové lampy dojde k výbuchu!
Před naočkováním obilí ve sklenicích nebo sáčcích se musí ve sklenicích nebo sáčku „rozdrtit“. To rozbije zrno na jednotlivá jádra a pomůže přerozdělit vlhkost v celé nádobě. Také stříkačka obsahující suspenzi spor by měla být také „protřepána“, aby se spory redistribuovaly v celém objemu tekutiny uvnitř.
Nasaďte jehlu na injekční stříkačku tak, že ji zatlačíte na základnu injekční stříkačky. Po nasazení jehly sejměte plastový kryt a samotnou jehlu zahřejte v plameni lihové lampy nebo butanové svítilny do červena.
Při používání butanového hořáku buďte opatrní, abyste nepopálili jehlu. Jehlu ochlaďte v alkoholu nebo pod laminárním prouděním v laboratorní skříni.
Pokuste se obsah stříkačky se suspenzí spor rovnoměrně rozdělit do všech sklenic (pokud je jich hodně) nebo použijte 2 mililitru suspenze na litrovou nádrž.
Pokud na sklenice této velikosti použijete méně než 1 mililitr kejdy, obsah sklenice bude pomalu kolonizovat a vystaví zrno riziku kontaminace. Pokud kladete „klínek“ agaru, použijte dva nebo tři klínky na stejný objem zrna.
Pro proces očkování jednoduše propíchněte butylkaučukový port jehlou a vstříkněte do něj 2,5 mililitru suspenze spor. Zkuste suspenzi nalít po stranách sklenice a trochu doprostřed. Voda v injekční stříkačce stékající dolů unese spory s sebou.
Pokud používáte jiný typ sklenice, jednoduše propíchněte silikonový port uprostřed a udělejte to samé. Před každým inokulačním procesem nezapomeňte jehlu zapálit v plameni kahanu nebo lihové lampy a zchladit (v proudu vzduchu nebo v lihu).
To je vše. Poté umístěte zrno do inkubátoru s teplotou 27 – 28 °C (až 30 °C) pro mycelium houby psilocybe cubensis.
Inkubační proces by měl probíhat v úplné tmě. Po čtyřech dnech se podívejte, jak probíhá proces kolonizace obilím. Proces vzniku vláken mycelia (sotva viditelných bílých pavučin) by již měl začít, pokud ne, nechte zrno další čtyři dny. Jakmile obilí ve sklenici přeroste z jedné třetiny, „zatřeste“ nádrž s obilím. To pomůže rozmístit mycelium rovnoměrně v celém zrnu a distribuovat vlhkost po celém jeho objemu. Po úplném zanesení sklenice (může to trvat až 18 dní a závisí na mnoha faktorech) sklenici znovu zatřeste a obilí již můžete použít k procesu pěstování hub nebo k naočkování substrátu.
K „lámání“ zrna nepoužívejte holou ruku! V plechovce mohou být mikrotrhliny a plechovka může prasknout a zranit vás! K tomu použijte buď silnou rukavici nebo měkkou loketní opěrku staré židle nebo „plešatou“ pneumatiku auta.
Přílohy B. Výroba vápenné vody dané koncentrace.
K přípravě této vody je potřeba zakoupit balení nehašeného vápna. Otevřete sáček a nasypte část obsahu do kbelíku a naplňte jej vodou v poměru jeden hmotnostní díl vápna ke čtyřem hmotnostním dílům vody. Přidejte vodu do kbelíku s vápnem a proces hašení začne. Zakryjte horní část kbelíku hadrem, protože tento proces zahrnuje uvolňování páry. Po ukončení procesu kalení přidejte dalších deset dílů (až 50 dílů) vody a důkladně promíchejte. Tekutina by měla být ve formě „mléka“ a ne ve formě „zakysané smetany“ (přidejte více vody). Nechte toto „mléko“ usadit a po dni se rozdělí na čirou tekutinu a pevný sediment. Právě tuto čirou tekutinu potřebujeme jako koncentrát.
Nyní spočítejme, kolik této kapaliny potřebujeme na jeden litr vody k přípravě 2% roztoku. Protože se jedná o nasycený roztok, jeho koncentrace bude 100% (ve skutečnosti 97%). K výběru tohoto koncentrátu je velmi vhodné použít 20 mililitrové (nebo velké) stříkačky a připravit roztok o koncentraci, kterou potřebujeme.
Pokud není vyžadována zvláštní přesnost, při ředění roztoků nebo jejich míchání za účelem získání roztoků jiné koncentrace, můžete použít následující jednoduchou a rychlou metodu.
Pro náš účel nepotřebujeme tak přesnou koncentraci (nezabýváme se analytickou chemií a koncentrace samotného roztoku se udává v širokém rozmezí od 0,5 % do 2 %), takže pro výpočet koncentrace použijeme jednoduché pravidlo – „křížová metoda“ . Tato metoda se používá k přípravě z koncentrovanějších roztoků, méně koncentrovaných (což je to, co potřebujeme). Toto je pravidlo. Nejprve si zapíšeme koncentraci roztoku, kterou máme (5% vápenný roztok).
Do levého horního rohu zapíšeme koncentraci roztoku, který máme (97 %), a do levého dolního rohu množství vody, které musíme přidat (to je nula), a doprostřed zapíšeme koncentrace, kterou bychom měli získat (2 %).
Nyní odečteme 97 od 2 a dostaneme 95 a zapíšeme tyto hodnoty do pravého dolního rohu a odečteme nulu od dvou a dostaneme 2 a zapíšeme tuto hodnotu do pravého horního rohu. Diagram vypadá takto:
co to všechno znamená?
Musíte vzít 2 objemy roztoku o koncentraci 97% a přidat do něj 95 objemů čisté vody. K výběru tohoto koncentrátu je velmi vhodné použít 20 mililitrové (nebo velké) stříkačky a připravit roztok o koncentraci, kterou potřebujeme.
Pro tento účel je také vhodné použít domácí kádinku, která se prodává v každém železářství (a používá se k vaření měsíčního svitu).
K přípravě 1 litru roztoku tedy potřebujete: 10,55 mililitrů – 2 díly X mililitrů – 95 dílů, x = 95X10,55/2 = 501 mililitrů vody.
Použijte 21 mililitrů koncentrovaného roztoku (to není obtížné provést injekční stříkačkou) a 1 litr čisté vody. Nepoužívejte vodu z vodovodu, pokud si nejste jisti její „tvrdostí“.
Používejte vodu balenou nebo dešťovou, nebo pokud jste si jisti „tvrdostí“ vaší vody.
